如何讓你的HPLC數據質量及重現性臻于完美？

01 試劑質量

梯度洗脫比較容易在柱頭端累積A和B溶劑中的非極性雜質，會在隨后的梯度過程中逐漸釋放這些雜質。這些雜質有可能在空白樣品和實際樣品的測試過程中出現。出于這個原因我們有必要在進行梯度實驗的時候使用HPLC級別的試劑。低質量的試劑可能適用于等度洗脫，但是在梯度洗脫中，即便是最微不足道的雜質也可能會造成測試異常的問題。為了獲得最佳的實驗結果，我們應該確保在所有的HPLC實驗中只使用HPLC級別的試劑。

水性試劑和緩沖液應該經常更換，這樣可以避免微生物生長而造成的污染，水中的雜質尤其會造成很多問題。

02 系統的清潔

和試劑的質量一樣重要，保持儀器清潔有助于減少鬼峰的出現，建議勤沖儀器。如果遇到其他問題，如液體溢出、漏液和其他潛在的污染源都應該及時得到清理。

03 除氣

雖然一些HPLC系統在流動相沒有除氣的情況下也可以運行，但是采用除氣后的溶劑會使所有系統的運行都變得更可靠。殘存的氣泡和溶劑中氣體溢出的現象，都可以通過對溶劑的除氣而大量避免。

另外，HPLC系統中也會有殘存氣體，每天都沖洗泵和溶劑的入口管線，不失為一個好主意。我們可以通過開啟purge閥和以較高的流速（例如5mL/min）對泵進行幾分鐘的沖洗來移除泵和管線內的氣泡。

04 專用的色譜柱

每個分析方法都應該有一根專用色譜柱。在不同的方法之間共用一根柱子并不是一個好主意，因為一個方法中無關緊要的色譜峰可能會變成第二種方法中的干擾峰。樣品成分可能會導致色譜柱的填料選擇性發生改變，或者其中一個方法造成柱子的退化。

05 平衡

在每次實驗之前，柱子應該恢復平衡到同樣的程度，為后續的分離實驗做好準備。wan全平衡對于梯度洗脫來說是十分必要的。

06 初始進樣

如果在第一次進樣之前，進行幾次“初始”進樣，那么一些方法就可以獲得更好的結果。這些標準品或者模擬樣品的進樣，可以飽和色譜柱上緩慢平衡的活性部位，因此可以獲得重現性更好的實驗結果。初始進樣對于分離生化樣品更有用。有時候系統適用性進樣也可以用作初始進樣。

07 忽略第一次進樣

因為一些方法要求使用初始進樣的程序，而且第一次進樣的平衡狀態可能和隨后進樣的不一致；因此最好避免使用第一次進樣做定量分析。第二次和隨后的進樣比第一次進樣更加可靠；在正式進樣之前展開的系統適用性試驗也能用于這個目的。

08 系統適用性

很多在監管部門（FDA、EPA、OECD、USP等）監管下的方法都要求在分析樣品之前做一個系統適用性的測試。系統適用性有助于確認設備和分析方法能夠產生可靠的實驗結果。

系統適用性測試的要求各有不同，所以相關人員應該咨詢有關的法規指導來幫助選擇合適的測試方法，很多操作者使用保留時間和峰面積的重現性、色譜峰的響應（檢測敏感度）、峰寬、色譜峰的拖尾、分離度和柱壓，這些其中一種或者綜合的方法，作為系統適用性測試的一部分。

系統適用性的樣品可以是稀釋了的標準品、萃取基質中的模擬樣品或者一些被選用來展示系統性能的樣品。這里一個重要的原則是，所選擇的系統適用性樣品必須可以用來測試方法中的操作是否能達到所期望的目的。無論是否需要進行系統適用性測試，在常規分析之前做一次這樣的測試不失為一個明智的選擇，哪怕就只是注射一個標準品看看保留時間和峰大小是否和預期一樣。

09 標準品和校正品